细胞质膜微囊蛋白1敲除小鼠神经干细胞培养与生物学特性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.23.022

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (23): 3739-3744.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.23.022

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

细胞质膜微囊蛋白1敲除小鼠神经干细胞培养与生物学特性

刘柏炎^1，2，俞悦¹，易健¹，陈雪梅¹，蔡光先¹

¹湖南中医药大学，湖南省长沙市 410007；²益阳医学高等专科学校，湖南省益阳市 413000

修回日期:2014-03-07 出版日期:2014-06-04 发布日期:2014-06-04
作者简介:刘柏炎，男，1970年生，湖南省隆回县人，汉族，2002年中南大学毕业，博士，教授，博士生导师，从事中西医结合防治脑血管疾病及神经干细胞研究。
基金资助:
国家自然科学基金(30873355，81273989)，国家重点基础研究发展计划(973计划)( 2010CB530400)，2012年度湖南省高校创新平台开放基金项目(12K089)

Culture and biological characteristics of neural stem cells from caveolin-1 knockout embryonic mice

Liu Bai-yan^{1, 2}, Yu Yue¹, Yi Jian¹, Chen Xue-mei¹, Cai Guang-xian¹

¹Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410007, Hunan Province, China; ²Yiyang Medical College, Yiyang 413000, Hunan Province, China

Revised:2014-03-07 Online:2014-06-04 Published:2014-06-04
About author:Liu Bai-yan, M.D., Professor, Doctoral supervisor, Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410007, Hunan Province, China; Yiyang Medical College, Yiyang 413000, Hunan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No.30873355, 81273989; the Major State Basic Research Development Program of China (973 Program), No.2010CB530400; the Open Innovation Platform Project for Universities in Hunan Province, No.12K089

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究发现细胞质膜微囊蛋白1在哺乳动物脑内表达，参与脑的正常发育，能影响脑内神经干细胞的增殖。

目的：从细胞质膜微囊蛋白1敲除小鼠脑内获取神经干细胞并观察其生物学特性。

方法：分别取E14-E16正常C57BL/6胚胎小鼠和细胞质膜微囊蛋白1敲除C57BL/6胚胎小鼠全脑，采用酶消化法获得单细胞悬液，置神经干细胞条件培养基中培养，原代培养7 d后，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基诱导7 d。

结果与结论：从两种胎鼠脑内获取的细胞悬液培养1 d后较多细胞发生死亡，可见单个细胞漂浮于培基中，透光度较好，3 d后逐渐形成悬浮生长的多细胞团。传代后培养板底部可见少量细胞发生贴壁，7 d后可见大量细胞团出现，且细胞质膜微囊蛋白1敲除胎鼠源细胞增殖速度更明显。免疫细胞化学检测显示，两种胎鼠来源细胞团均为巢蛋白阳性，分化细胞可见神经丝蛋白200、胶质纤维酸性蛋白或O4阳性表达；正常C57BL/6胎鼠来源细胞团呈细胞质膜微囊蛋白1阳性表达，而细胞质膜微囊蛋白1敲除C57BL/6胎鼠来源细胞团呈细胞质膜微囊蛋白1表达阴性，且神经干细胞成球速度和成球数量优于正常胎鼠神经干细胞。说明实验成功从细胞质膜微囊蛋白1敲除胎鼠脑内培养出细胞质膜微囊蛋白1缺失神经干细胞，细胞质膜微囊蛋白1可促进神经干细胞的增殖，并抑制其分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 培养, 神经干细胞, 细胞质膜微囊蛋白1, 生物学特性, C57BL/6胎鼠, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Caveolin-1 is expressed in mammalian brain and involved in the normal development of the brain, which can affect the proliferation of neural stem cells in the brain.

OBJECTIVE: To acquire neural stem cells from caveolin-1 knockout embryonic mice in vitro and study their biological characteristics.

METHODS: The whole brain was separated from C57BL/6 mice and caveolin-1 knockout C57BL/6 mice respectively at encyesis 14-16 days. Single cell suspension was obtained by enzyme digestion, and cultured in the conditioned medium of neural stem cells. Following 7 days of primary culture, the cells were induced in Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham’s nutrient mixture F-12 containing 10% fetal bovine serum for 7 days.

RESULTS AND CONCLUSION: The major cells of the cell suspensions from the fetal mouse brain were dead at 1 day after culture, and some single cells floated in the medium and their transmittance were better, and then they gradually formed multicellular balls after 3 days. A small amount of cells were adhered at the bottom of culture plate after passage, and a great amount of cell balls appeared after 7 days. The proliferation rate of neural stem cells from caveolin-1 knockout mice was higher than that from normal mice. The cell balls were nestin-positive and their differentiated cells was positive for neurofilament 200, glial fibrillary acidic protein or O4, respectively. All of the cells from normal mouse brain were positive for caveolin-1, but the cells from caveolin-1 knockout mice were negative for caveolin-1 by immunocytochemistry. Moreover, the speed of cell ball formation and the number of cell balls in neural stem cells from caveolin-1 knockout mice were better than those from normal mice. Caveolin-1 negative neural stem cells were cultured successfully from caveolin-1 knockout mouse brain, and the results show that caveolin-1 can promote the proliferation of neural stem cells and inhibit their differentiation in vitro.

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Key words: stem cells, neural stem cells, caveolins

中图分类号:

R394.2

刘柏炎，俞悦，易健，陈雪梅，蔡光先. 细胞质膜微囊蛋白1敲除小鼠神经干细胞培养与生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(23): 3739-3744.

Liu Bai-yan, Yu Yue, Yi Jian, Chen Xue-mei, Cai Guang-xian. Culture and biological characteristics of neural stem cells from caveolin-1 knockout embryonic mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(23): 3739-3744.

图/表（结果） 2

2.1 神经干细胞生长情况观察结果 两种来源细胞悬液接种1 d后，镜下可见较多细胞发生死亡，表现为透光度较差的小点，其间可见单个细胞漂浮于培基中，部分为数个细胞的聚集，和周围悬浮细胞碎片相比，呈透光度较好的亮点。原代培养两三天后，悬浮细胞碎片间可见一定数量的细胞聚集，形态较为规则，多为类圆形或近圆形，胞体通透，呈悬浮生长，第1次换液后，悬浮细胞碎片较之前明显减少，神经干细胞生长迅速，可见有较多细胞团聚集，大小不一，形态各异，呈球型、长椭圆型或桑葚型悬浮生长。采用accutase消化加机械吹打的方式传代后，可见呈悬浮生长的单细胞逐渐形成球形克隆，成球速度快于原代培养，同时可见培养板底部细胞部分发生分化(图1)。

2.2 神经干细胞的鉴定结果 免疫细胞化学检测显示，附着于多聚赖氨酸包埋盖玻片上的细胞球均呈巢蛋白抗原强阳性(图2)。

2.3 诱导分化细胞鉴定结果 加入血清诱导2 d后，两组可见细胞球贴壁，细胞团周围长出长短不一的突起，7 d中小细胞球基本铺展开，部分细胞移行至一定距离，细胞呈胞体形态不一带突起的细胞。免疫细胞化学检测显示，两组细胞可分别呈神经丝蛋白200、胶质纤维酸性蛋白和O4抗原阳性(图2)。

2.4 细胞细胞质膜微囊蛋白1表达鉴定 来源于正常胎鼠的神经干细胞和分化细胞均呈细胞质膜微囊蛋白1阳性表达，而来源于细胞质膜微囊蛋白1敲除胎鼠的神经干细胞和分化细胞细胞质膜微囊蛋白1表达均呈阴性(图3)。

2.5 细胞质膜微囊蛋白1对神经干细胞增殖的影响 采用克隆球计数的方法对两种来源胚胎神经干细胞进行计数发现，细胞质膜微囊蛋白1敲除胎鼠神经干细胞成球速度和成球数量优于正常胎鼠神经干细胞，两组比较差异有显著性意义(P < 0.05，图3，表1)。

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引言

随着老龄社会到来，神经损伤和退行性疾病发病率不断增加，据新近统计，中国国民死亡原因之首为脑血管病，高达22.45%^[1]，而由此造成的认知、运动功能减退给社会、家庭带来了严重的负担。

传统观点认为，成年哺乳动物大脑是终末器官，一旦受到损伤就无法修复。但自20世纪90年起大量实验发现，成体脑内多个部位如前脑、皮质、海马存在神经干细胞，一类具有自我增殖和多向分化能力的细胞群，主要以沉默静止的状态分布于海马颗粒层和侧脑室旁区，并受细胞内外因素的调控^[2-3]。神经生长因子如表皮生长因子、脑源性生长因子等参与了神经干细胞增殖、分化的全过程。碱性成纤维生长因子作为神经干细胞的主要有丝分裂因子，通常与表皮生长因子联用，在体外维持细胞的生长于增殖^[4]。

脑缺血后由于血流的中断、能量匮乏导致细胞缺氧、坏死，氧自由基大量蓄积，钙超载，释放白细胞介素、肿瘤坏死因子而引起炎症级联反应，另一方面，机体内在保护机制可调节脑源性神经营养因子等水平。这些病理生理变化改变了神经干细胞所处的微环境，进而影响其生物学特性。

传统观念认为炎症等细胞因子由胶质细胞分泌，诱导免疫细胞吸附至组织损伤部位以减轻损伤。近来研究发现其在中枢神经系统中有广泛的非免疫作用，包括调节神经干细胞的增殖、移行、分化与突触形成^[5-6]。如肿瘤坏死因子是一种重要的前炎症因子，在脑缺血损伤后表达明显增高，升高的肿瘤坏死因子抑制海马神经前体细胞的向神经元分化，促进向胶质细胞分化^[7-8]；脑源性神经营养因子与表皮生长因子合用能显著提高神经干细胞的增殖与移行，促进神经干细胞元血管迁移至缺血损伤部位^[9-10]，激发的神经干细胞增殖并移行至损伤区分化为成熟神经元^[11-12]，脑缺血后2 d啮齿动物室旁区分裂细胞达24%，7 d达高峰期，14 d分裂水平与缺血后2 d相近^[13]，这种现象不仅在成体动物脑内，在老年大鼠也得到证实，也存在与人类缺血损伤的脑中^[14]。这些研究为中枢神经系统再生和功能重建提供了新的可能途径，但除移行至海马的neuroblasts存活外，其他部位的神经没有存活，且有内源性神经干细胞分化的神经元不及死亡细胞的0.2%^[15-16]。因此，如何调控神经干细胞的增殖分化及新生神经细胞的存活对脑卒中治疗十分重要。

细胞质膜微囊蛋白1是新近发现的一种膜蛋白，广泛表达于多种组织细胞表面，最先发现在内皮细胞上，随后发现在平滑肌细胞和肿瘤细胞上均有表达^[17-18]，能与具有“细胞质膜微囊蛋白结合域”的多种信号蛋白质分子如酪氨酸激酶类膜受体、类固醇激素受体、生长因子受体等结合，对许多关键性信号分子的活性状态起直接调控作用，从而参与细胞分化、增殖等多种病理、生理过程^[19]。

目前细胞质膜微囊蛋白1主要研究集中于脂质转运、血管重建和肿瘤研究等方面，它能促进内皮祖细胞增殖、移行、分化与血管形成，与肿瘤细胞的的侵袭、迁移有关，并促进锚地独立的增长^[20-22]，在神经生物学研究尚处于开始阶段。研究发现，细胞质膜微囊蛋白1在哺乳动物脑内表达，参与脑的正常发育^[23]，能影响脑内神经干细胞的增殖^[24]。实验从细胞质膜微囊蛋白1敲除小鼠获取神经干细胞以及细胞质膜微囊蛋白1对神经干细胞的影响，以期明确神经干细胞的调控机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：体外细胞学实验。

时间与地点：2011年3月至2012年6月湖南中医药大学内科实验室完成。

材料：妊娠14-16 d C57BL/6小鼠由湖南斯莱克景达实验动物公司提供，许可证号SCXK(湘)2009-0004；细胞质膜微囊蛋白1基因敲除C57BL/6小鼠购自美国Jackson Laboratory，授权号2909619。实验过程中对动物的处置符合2006年科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定^[25]。

实验方法：

神经干细胞条件培养基配置：DMEM/F12(1∶1)加2%B27、20 μg/L表皮生长因子、20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子和10 mL/L非必须氨基酸。

神经干细胞的分离与培养：取妊娠14-16 d(阴栓出现日作为0 d)C57BL/6或细胞质膜微囊蛋白1敲除小鼠断颈处死，浸泡于体积分数为75%的乙醇中消毒，无菌条件下剪开腹部组织，取出胎鼠置于装有75%乙醇的30 mL小烧杯中，漂洗羊水及血液后，无菌操作依次剪开皮肤、颅骨，完整取出脑组织，移至培养皿中，用预冷的PBS冲洗3次以去除血污，转置盛有神经干细胞培养基的培养皿中，去视束、小脑，以眼科镊小心剥离脑膜和血管。收集脑组织于离心管中，采用机械吹打的方法，反复吹打将组织制备成细胞悬液，800 r/min离心5 min，弃上清得到细胞沉淀^[26]。加入神经干细胞条件培养基重新悬浮细胞沉淀，调整细胞浓度为2×10⁸ L^-¹，接种于6孔板中，置37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度环境的恒温培养箱中。待神经干细胞球形成后，收集至离心管，加入accutase液，同时反复轻柔均匀吹打，尽量消化细胞，细胞悬液按原培养密度接种到新的培养瓶，置培养箱中继续培养。

神经干细胞鉴定：对原代和传代神经干细胞进行巢蛋白免疫细胞化学检测。取悬浮生长的克隆球，接种于培养皿中，其中预置经多聚赖氨酸包被过的盖玻片，于培养基中添加体积分数10%胎牛血清以促进神经球贴壁。37 ℃，体积分数5%CO₂培养2 h后取出盖玻片。吸去培养基，PBS漂洗3次，5 min/次。40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS漂洗后进行免疫组织化学检测，具体步骤参考文献[27]，观察染色情况，待标本显色后倒掉染液，用蒸馏水充分冲洗以终止染色，干燥后封固，显微镜观察结果并拍照。

神经干细胞增殖能力鉴定：采用克隆球计数检测^[28]：收集生长期的神经干细胞，采用accutase消化液37 ℃消化3 min，将神经球机械吹打散开，制成单细胞悬液，调节细胞浓度为1×10⁶L^-¹，接种于12孔板中，每孔1 mL细胞悬液。培养3在低倍镜下进行神经球计数，纳入计数的神经球需包含5个以上细胞。实验重复3次。

神经干细胞的诱导分化：取第2代培养3 d的神经干细胞，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12进行诱导分化，7 d后细胞贴壁分化后行免疫细胞化学检测，步骤同神经干细胞巢蛋白检测，分别用1∶500稀释的神经丝蛋白200、胶质纤维酸性蛋白和O4抗体代替巢蛋白抗体。同时用正常山羊血清和PBS代替一抗作空白对照以检查免疫反应的特异性。

细胞质膜微囊蛋白表达检测：取原代和传代神经干细胞进行免疫细胞化学法检测，方法同前，用1∶500稀释的细胞质膜微囊蛋白1抗体代替巢蛋白抗体。

主要观察指标：神经干细胞的生物学特性，神经干细胞的鉴定、增殖与分化结果，细胞质膜微囊蛋白1表达结果及对细胞增殖的影响。

统计学分析：细胞增殖能力所有数据以x(_)±s表示，由第2作者应用SPSS 11.0统计软件包对数据进行统计分析，组间比较用单因素方差分析，P < 0.05被认为差异有显著性意义。

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讨论

自1992年Reynods首次在成年小鼠脑内分离培养出神经干细胞以来，作为一类具有多向分化潜能的细胞，目前绝大多数哺乳动物脑内均被证实存在，它们在生理状态下以静止未增殖状态存在，当机体或脑组织受到损伤时被激活^[29]，激活后的神经干细胞如何分化是目前研究的重点。如研究发现，当脑缺血损伤或退行性改变时，神经干细胞被激活，但只有极少数移行并分化为成熟的神经元，其数量不足以补偿损伤细胞^[30]。细胞分化受细胞内外信号的精确调控，如神经生长因子、碱性成纤维生长因子细胞外信号和neuroD等细胞内信号均证实有助于神经干细胞增殖与存活^[31]，但内外信号的转导上欠明确。

Caveolae是细胞质膜表面特异性的内陷微区结构，主要由脂类和蛋白质组成，参与分子转运、细胞脂质代谢和信号转导等多种生理过程^[32]。细胞质膜微囊蛋白是相对分子质量为22 000的结构蛋白，是细胞质膜结构小窝(caveolae)的标志蛋白。目前在哺乳动物细胞已确定的细胞质膜微囊蛋白家族成员有细胞质膜微囊蛋白1、细胞质膜微囊蛋白2和细胞质膜微囊蛋白3三种分子，细胞质膜微囊蛋白1作为Caveolae主要蛋白，广泛表达于内皮细胞、脂肪细胞和心肌细胞等细胞类型中，对维持Caveolae的结构功能具有重要作用^[33]。细胞质膜微囊蛋白1通过其绞手架结构域能寡聚Ha-RAS、c-Src、eNOS、PKC等多种信号分子，调节信号转导过程^[34]，参与了许多生理与病理过程。

细胞质膜微囊蛋白1在神经系统中分布广泛，在大脑皮层、小脑、海马、黑质等多个部位都有表达，能影响胚胎发育中侧线神经丘和脊索发育，调控血脑屏障的功能^[35-36]，通过作用于notch信号而调节骨髓间充质细胞向神经元分化^[37]。新近发现，细胞质膜微囊蛋白1可表达于胚胎干细胞源性神经干细胞和培养的神经球^[38]，细胞质膜微囊蛋白1敲除能增强成年小鼠脑内室旁区神经干细胞的增殖^[24]，促进神经干细胞向胶质细胞分化，抑制向神经元分化^[39-40]，但尚未见体外缺失神经干细胞的报道。

实验在体外从两种小鼠胚胎脑中都成功获得了神经干细胞，且来源于细胞质膜微囊蛋白1敲除胎鼠的神经干细胞及其分化细胞均呈细胞质膜微囊蛋白1阴性，结果显示可从细胞质膜微囊蛋白1敲除鼠内获取细胞质膜微囊蛋白1缺失神经干细胞；同时实验还发现，细胞质膜微囊蛋白1缺失可促进神经球的形成速度和数量，提示细胞质膜微囊蛋白1 能促进神经干细胞的增殖，与体内实验结果相似^[24]。实验结果一方面为体外研究细胞质膜微囊蛋白1在神经干细胞的作用机制提供平台，另一方面也为神经干细胞调控研究提供了平台。

细胞质膜微囊蛋白1敲除小鼠神经干细胞培养与生物学特性

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